Czynnik bakterii naczyń włosowatych – podejście do identyfikacji niehodowanych patogenów czesc 4

Każda reakcja zawierała 20 pmoli każdego startera i standardowe ilości odczynników Gene-Amp (Perkin-Elmer-Cetus), z tym wyjątkiem, że zastosowano 2 mM chlorek magnezu do amplifikacji z ekstraktami tkanki zatopionej w parafinie. Ta mieszanina została napromieniowana światłem ultrafioletowym, aby zmniejszyć zanieczyszczenie odczynników. Do probówek dodano warstwę sterylnego oleju mineralnego, a następnie szablon DNA. Cykle PCR obejmowały minutę denaturacji w 94 ° C, minutę wyżarzania w temperaturze 55 ° C i 1,5 minuty wydłużenia w 72 ° C w programowalnym regulatorze termicznym (MJ Research, Watertown, Mass.). W celu amplifikacji za pomocą ekstraktów z tkanki zatopionej w parafinie użyliśmy pliku kroków w zautomatyzowanym termocyklerze DNA (Perkin-Elmer-Cetus). Kontrole negatywne włączano podczas każdej amplifikacji i składały się z mieszanin reakcyjnych bez matrycy DNA, a także mieszanin reakcyjnych z ekstraktami DNA z nieużytych tkanek. Produkt PCR wykrywano przez elektroforezę 10 .l roztworu reakcyjnego w 1,2% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny; na standardowym poziomie DNA na każdym żelu zastosowano drabinkę DNA o wielkości kilobazy (kb) (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Oczyszczanie, klonowanie i sekwencjonowanie produktu PCR
Połowę produktu PCR wyekstrahowano fenolem i chloroformem, wytrącono etanolem i przeprowadzono w peletki. Końce 3 nici DNA wypełniono fragmentem dużej polimerazy I DNA (Klenow) 29. Produkt oczyszczono metodą elektroforezy w żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia, pocięto za pomocą kombinacji EcoRI i BamHI (New England Biolabs, Beverly Mass.), A następnie zligowano z wektorem phagemid pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA), który został pocięty za pomocą EcoRI i BamHI.29 Escherichia coli DH5. (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Md.). transformowano 32 rekombinowanymi plazmidami za pomocą pulsatora genowego Bio-Rad (Richmond, CA). Po skriningu opornych na ampicylinę transformantów dla odpowiedniego zrekombinowanego plazmidu, obie nici wstawek plazmidowych sekwencjonowano dwuniciowymi matrycami DNA (Seąuenase, US Biochemical, Cleveland) i metodą zakończenia łańcucha dideoksy31.
Analiza danych
Sekwencje dopasowywano ręcznie w oparciu o konserwatywne regiony i drugorzędne elementy strukturalne. Obszary o niejednoznacznym przyrównaniu zostały pominięte w analizie filogenetycznej. Ewolucyjną odległość dzielącą dwie sekwencje obliczono na podstawie procentu podobieństw34; metoda najmniejszych kwadratów została wykorzystana do wywnioskowania drzewa filogenetycznego najbardziej spójnego z obliczoną odległością.35 Wszystkie referencyjne sekwencje 16S rRNA otrzymano z baz danych GenBank (Los Alamos, NM) / European Molecular Biology Laboratory (Heidelberg, Niemcy).
Wyniki
Amplifikacja sekwencji 16R rRNA z ekstraktu tkankowego przy użyciu szerokozakresowych primerów eubakteryjnych
Zamrożoną tkankę śledziony od Pacjenta wybrano jako początkowy cel dla amplifikacji 16S rRNA z uwagi na stosunkowo dużą liczbę bakterii widoczną w barwieniu Warthin-Starry (Fig. 1B). Eubakteryjne primery o szerokim zakresie p22E i p13B zaprojektowano z sekwencji genu 16D rDNA, o których wiadomo, że są konserwatywne we wszystkich eubakteriach26, ale nie występują w eukariotycznych genach podobnych do 16S
[przypisy: salve wujaka, krwiak okularowy, metafolina ]