Czynnik bakterii naczyń włosowatych – podejście do identyfikacji niehodowanych patogenów cd

Nie miała żadnych zmian skórnych. Biopsja pachwinowego węzła chłonnego wykazała cechy histologiczne odpowiadające nabłonkowemu angiomatozie. Skupiska pałeczek były widoczne na barwieniu Warthin-Starry. Ekstrakcja DNA
DNA wyodrębniono z zamrożonego guzka śledziony i zamrożonego fragmentu śledzionowego węzła chłonnego z pacjenta 1, zamrożonej próbki szpiku kostnego od pacjenta 2, zatopionej w parafinie, utrwalonej w formalinie tkanki ze zmiany skórnej od pacjenta 3 i parafiny. -wybrany węzeł chłonny utrwalony w formalinie od Pacjenta 4. Każdy z tych pacjentów wykonywał biopsję w innym szpitalu. Jako kontrolę zanieczyszczenia kontaminacją DNA, dla każdej próbki pobranej z biopsji od pacjentów przygotowaliśmy ekstrakty DNA z co najmniej jednej z następujących tkanek: zamrożona śledziona od pacjenta z idiopatyczną plamicą małopłytkową, bez klinicznych lub kulturowych dowodów zakażenia; osadzoną w parafinie próbkę śledziony utrwaloną w formalinie uzyskaną przez splenektomię u ofiar traumy; i mrożony migdałek od dwóch pacjentów z nawracającym zapaleniem migdałków.
Frozen Tissue
Zastosowane metody zostały zmodyfikowane w stosunku do wcześniej opisanych.27, 28 Około 100 mg każdej tkanki przepłukano w sterylnej wodzie, zmielono i umieszczono w 5 ml buforu do trawienia (500 mM TRIS, pH 9, 20 mM EDTA, 10 mM sodu chlorek i procent dodecylosiarczanu sodu) ze świeżą proteinazą K (Sigma, St. Louis) w końcowym stężeniu mg na mililitr. Próbki inkubowano w 60 ° C przez 48 do 72 godzin. Rybonukleaza A (Sigma) została dodana do końcowego stężenia 4 .g na mililitr; próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie ekstrahowano trzy razy równymi objętościami buforowanego TRIS fenolu i alkoholu chloroform-izoamylowego (24: 1). DNA wytrącono etanolem zgodnie ze standardowymi technikami 29 i ponownie zawieszono w 50 .l jałowej wody.
Tkanka zanurzona w parafinie
Zastosowaną metodą była modyfikacja opublikowana przez Shibata i wsp. 30 i opisana przez Wrighta i Manosa. Dziesięć mikrometrów wyciętych z różnych blokowanych w parafinie bloków tkanki zostały przycięte, potraktowane oktanem i etanolem, a następnie umieszczone w 200 .l buforu do trawienia, jak opisano. 31 Po strawieniu i inaktywacji termicznej proteinazy K, mieszaninę reakcyjną odwirowano i supernatant zastosowano bezpośrednio w reakcjach amplifikacji.
Startery oligonukleotydowe
Tabela 1. Tabela 1. Startery oligonukleotydowe stosowane do amplifikacji 16S rDNA. * Sekwencje starterów p11E i p13B zostały zaadaptowane z modyfikacjami Chen et al. 26 Primery p93E, p24E i p12B zostały zaprojektowane na podstawie sekwencji 16S rRNA określone w tym badaniu (tabela 1). Każda z nich zawierała miejsce endonukleazy restrykcyjnej EcoRI lub BamHI na końcu 5 w celu ułatwienia klonowania powstałego produktu PCR. Wszystkie startery zostały zsyntetyzowane przez Operon Technologies (Alameda, CA).
Amplifikacja PCR
Ekstrakty DNA z zamrożonej tkanki doprowadzono do stężenia około 400 do 500 .g całkowitego DNA na mililitr; .l zastosowano w 100 .l objętości reakcyjnej. Dziesięć mikrolitrów (5 procent) ekstraktu DNA zatopionego w parafinie było wystarczające do amplifikacji ludzkich genów .-globiny za pomocą starterów PC04 i GH20 (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, Connecticut); taką samą ilość użyto do amplifikacji eubakteryjnego 16S rRNA
[podobne: drożdżówka kalorie, metafolina, olk med toruń ]