Czynnik bakterii naczyń włosowatych – podejście do identyfikacji niehodowanych patogenów ad 5

Wcześniejsze badania wykazały, że ilości pikogramów rDNA 16S E. coli można wykryć przy użyciu tych primerów jako sond hybrydyzacyjnych w obecności dużego nadmiaru eukariotycznego genomowego DNA.26 Figura 2. Figura 2. Elektroforeza w żelu agarozowym z fragmentów rDNA z amplifikacją PCR 16S z ekstraktów DNA tkankowego. Szerokopasmowe eubakteryjne primery 16S rDNA – p11E i p13B – zastosowano do reakcji w ścieżkach do 5. Zamplifikowano amplifikację fragmentu o wielkości 232 pz. Konkretne startery – p24E i p12B – zastosowano do reakcji odpowiadających ścieżkom od 6 do 12; generują fragment o wielkości 296 bp. Ścieżki i 6 nie zawierają dodanego ekstraktu DNA; ścieżki 2 i 7, próbkę śledziony od pacjenta z idiopatyczną plamicą małopłytkową; ścieżki 3 i 8, tkanka migdałkowa od pacjenta z nawracającym zapaleniem migdałków; ścieżki 4 i 9, próbkę śledziony od Pacjenta 1; ścieżka 5, próbka śledzionowego węzła chłonnego Hilara od Pacjenta 1; ścieżka 10, szpik kostny od Pacjenta 2; ścieżka 11, tkanka z biopsji zmiany skórnej od Pacjenta 3; i ścieżkę 12, tkankę węzła chłonnego od Pacjenta 4. Wielkość niektórych standardów DNA wskazano w kilobazach.
Po 25 cyklach amplifikacji PCR przy użyciu p11E i p13B oraz śledzionowego lub śledzionowego DNA węzła limfatycznego z Pacjenta jako celu, produkt o około 200 par zasad (bp) wykryto w sposób odtwarzalny z elektroforezą w żelu agarozowym (ryc. 2, ścieżki 4 i 5). Żadnego pasma DNA nie można było zamplifikować z próbki śledziony od pacjenta z idiopatyczną plamicą małopłytkową lub pod nieobecność dodanego ekstraktu tkankowego (ryc. 2, ścieżki 2 i 1, odpowiednio). W przypadku DNA z normalnej ludzkiej tkanki migdałków, gatunek DNA o podobnej wielkości był czasami ledwo widoczny, chociaż niełatwo go odtworzyć (ryc. 2, ścieżka 3). Można się tego spodziewać, ponieważ taką tkankę uzyskano z miejsca skażonego normalną florą śluzówkową. Po 35 lub więcej cyklach amplifikacji PCR z p11E i p13B, słabe prążki można było czasami zaobserwować we wszystkich mieszaninach reakcyjnych.
Określanie sekwencji i rozwój konkretnych podkładów
Fragment DNA amplifikowany z ekstraktu śledziony z Pacjenta oczyszczono, sklonowano, a następnie zsekwencjonowano. Porównanie tej sekwencji ze wszystkimi znanymi sekwencjami DNA w bibliotekach danych GenBank / Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej pokazało, że ten fragment o długości 232 par zasad mógłby łatwo zostać zrównany z eubakteryjnymi genami 16S rRNA, ale nie był identyczny z jakąkolwiek znaną sekwencją. Nowy organizm reprezentowany przez tę sekwencję oznaczono szczepem BA-TF. Zaprojektowano nowy starter, p93E, który odpowiada wysoce konserwatywnej sekwencji 16S rRNA w górnym miejscu. Za pomocą tego primera i p13B produkt DNA o długości 480 pz został zamplifikowany z ekstraktu śledziony z Pacjenta 1, ale nie pochodził od pacjenta z idiopatyczną plamicą małopłytkową lub z innych niedotlenionych ekstraktów DNA śledziony (dane nie pokazane). Na podstawie sekwencji tego fragmentu o wielkości 480 pz zaprojektowano dwa startery swoiste dla BA-TF – p24E i p12B – (tabela 1). Te dwa miejsca starterów są oddzielone 241 bp i są maksymalnie rozbieżne ze znanymi sekwencjami rRNA 16S eubakterii w tych regionach.
Dwa specyficzne startery odtwarzały w sposób odtwarzalny fragment DNA o spodziewanej wielkości z próbki śledziony (Fig
[hasła pokrewne: nzoz morena, nasiadówka z kory dębu, białko ostrej fazy crp ]